对于悬浮细胞,HAKATA细胞库一般选择2种发货形式,1瓶为T25瓶的,1管为离心管形式,离心管形式的操作方式:收到离心管酒精消毒放入培养稳定2-4H后进行1000rpm离心5min。去除上清后保留细胞沉淀用新鲜培养基重悬混匀转移至培养瓶进行培养,接种后培养瓶竖着放入培养箱,次日不移动,第三日观察细胞的状态及密度。详细说明如下:
1. NK-92细胞为悬浮生长,大部分细胞聚集成团,少数分散的细胞,并且细胞间隙会有较多的死细胞和细胞碎片;
2. NK-92细胞对营养需求很高,建议使用进口胎牛血清和马血清培养,白介2的质量对NK-92的生长影响很大,正常培养时换液周期为2天,建议使用半量换液和离心换液交替进行,即半量换液1-2次后离心全量换液一次,尽量减少离心次数;
3. 细胞生长时聚集的细胞团会逐渐增大,正常的细胞团显微镜下为白色透亮的,若细胞聚集太多,出现细胞团中部发暗时可在换液后将细胞团轻轻摇散,或者用移液器轻轻吹散,吹打力度不可过大,否则会出现大量死细胞和细胞碎片。这个细胞没有聚团的活性很低。细胞对营养要求也很高,千万不能团块太大营养不足,不然48小时细胞就会死亡。这个细胞计数是不准确的 因为细胞成团长,团块不可能吹散计数,还有就是散落的细胞细胞活性不好,所以细胞检测活性也是不准确的。
4. 运输条件可能会对细胞造成一定的影响,收到细胞后请按以下方法处理:
a) 收到细胞后静置,显微镜下观察细胞并拍照,主要找聚集的细胞团;
b) 将培养瓶竖置,静置4~6h,肉眼观察大部分细胞团都沉到底部后,将多余的培养基轻轻倒入50ml离心管中离心收集一部分细胞,底部留3~4ml(剩余20ml左右时可换用移液器吸取上清,保证大部分细胞团留在瓶中),补加3~4ml新鲜培养基进行培养,若细胞量较多可分两瓶,离心收集的细胞也可单独接种培养;
c) 细胞对机械损伤特别敏感,所以最好是不要离心
5. 细胞复苏时不能离心处理,提前准备一个离心管,加10ml培养基,把溶解后的冻存细胞接入,静置2小时左右,细胞都沉降在底部,去上清,用完全培养基接到T25培养瓶内进行培养
特别注意
细胞是聚团的,肉眼能观察到,尽量多吸掉上清液,只能留500ul左右,然后加入随货赠送的完全培养基5ml 轻轻摇晃至细胞团有部分松开,细胞尽量不要离心,不要用枪头去吹,细胞传代的时候也是一样的额,直接补加对应体积完全培养基摇晃培养瓶后分瓶,不要吹打。换液的时候也是竖着培养后吸掉上清液后加完全培养基就可以,细胞不要离心不要吹打。
