LAD2细胞系培养注意事项

一、 细胞基本特性与培养要求

• 细胞类型：LAD2悬浮细胞系

• 倍增时间：约 15 天（生长极其缓慢，需保持耐心，避免过度干预）

• 培养容器：必须使用透气孔培养瓶，或使用不透气培养瓶时务必拧松瓶盖以保证气体交换

• 放置方式：全程保持竖放培养

二、 培养基准备与保存规范

LAD2 细胞对生长因子极其敏感，请严格遵守以下配制与保存流程：

1. 分装保存：收到完全培养基后，立即在无菌环境下分装为 50ml/支。

2. 冷冻条件：分装后即刻放入 -20℃ 冰箱保存（因子有效期极短，严禁反复冻融）。

3. 解冻预热：

• 使用前，提前将培养基移至 4℃ 冰箱过夜解冻。

• 实验前，将解冻后的培养基置于 37℃ 水浴中预热至室温/体温。

三、 日常培养操作流程

1. 初始复苏/接种培养

1. 向培养瓶中加入 10ml 预热好的完全培养基。

2. 将培养瓶竖放于培养箱中。

3. 每隔 24 小时，轻轻补加 3ml 新鲜完全培养基，直至液面达到瓶身 1/2 高度。

4. 当液面达到 1/2 高度后，将瓶内液体全部吸出。

5. 将吸出的液体转移至离心管，低速 800 rpm 离心 5 分钟。

6. 弃上清，加入 20ml 新鲜完全培养基，轻轻吹打重悬细胞（切忌剧烈吹打）。

7. 将细胞悬液平均分装至 2 个新培养瓶中。

8. 后续按“日常维护”流程继续隔天补液。

2. 日常换液与维护

1. 保持培养瓶竖放，每天补加新鲜完全培养基，使液面接近瓶身 2/3 高度。

2. 换液时，使用移液管从液面上层轻轻吸出一半悬液（避免吸走底部细胞）。

3. 将吸出的悬液转移至离心管，低速 800 rpm 离心 4 分钟。

4. 弃上清，加入 1ml 完全培养基将细胞轻轻重悬。

5. 将重悬的细胞液接种回原培养瓶中。

6. 瓶内剩余的培养基继续保留，隔天补加 2ml 新鲜完全培养基。

3. 传代时机与操作

传代指征（满足以下任一条件即需传代）： - 培养基颜色完全变黄/变色（提示代谢物积累过多）。 - 细胞密度超过 1×10⁶ 个/ml（在半换液吸取上层悬液时取样计数）。

传代操作步骤： 1. 将瓶内液体全部吸出，低速 800 rpm 离心 5 分钟。 2. 弃上清，加入 20ml 新鲜完全培养基，轻轻重悬细胞。 3. 将细胞悬液平均分装至 2 个新培养瓶中。 4. 培养瓶竖放，后续继续隔天补加 2ml 新鲜完全培养基，循环此流程。

⚠️ 核心注意事项（红线警告）

�� 严禁频繁离心 LAD-2 细胞极其脆弱，离心造成的机械损耗极大。必须尽量减少离心次数，仅在初始培养收细胞、日常半换液及传代时进行离心。

�� 严禁高速离心 全程仅允许使用 800 rpm 低速离心。高速离心会导致细胞不可逆损伤甚至死亡。

• 及时传代：一旦培养基完全变色或密度超标，必须立即传代，切勿拖延，否则细胞状态会 迅速恶化且难以恢复。

• 无菌操作：每次补液、换液、传代均需在生物安全柜内严格遵循无菌操作规范，防止污染。

• 动作轻柔：所有涉及细胞重悬的步骤，必须轻轻吹打或晃动，严禁剧烈震荡或用力吹打。